Флокуляционные тесты (RPR, VDRL, USR, TRUST)
Реакция преципитации (РП) — это выпадение в осадок специфического иммунного комплекса, состоящего из растворимого антигена и специфического антитела в присутствии электролита. Образующееся в результате реакции мутное кольцо или осадок называется преципитат. Разновидностью преципитации является реакция флоккуляции (по Рамону, Ramon)— появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) при при смешении токсина с соответствующей иммунной сывороткой (реакции токсин- антитоксин или анатоксин- антитоксин).
Вскоре после открытия комплементсвязывающего теста было установлено, что реакцию между вассермановским антигеном и сифилитическими сыворотками можно обнаружить по преципитации (флокуляции). Феномен образования преципитата при смешивании липоидного антигена с сывороткой или плазмой крови больного сифилисом был описан Michaelis в 1907 году.
https://www.youtube.com/watch?v=ytadvertiseru
Это стало основой для разработки множества технических модификаций флокуляционного кардиолипинового теста на сифилис. Благодаря простоте, возможности стандартизации, дешевизне и скорости выполнения, они вытеснили из клинической практики классическую реакцию Вассермана и в настоящее время широко используются для скрининга сифилисной инфекции.
Осадочные тесты — цитохолевую реакцию Закс-Витебского и реакцию Кана — в течение длительного времени применяли в составе комплекса стандартных реакций (КСР) для диагностики сифилиса. Исследование проводили в пробирках, в качестве антигена использовали оригинальные прописи, включающие в себя кардиолипин, холестерин и лецитин в различных пропорциях, при этом не требовалось дополнительного введения комплемента. Образующийся комплекс микрофлоккулята был виден невооруженным глазом.
В последующие годы при модификации с целью повышения качества кардиолипин-холестерол-лецитинового антигенного комплекса были разработаны и предложены различные коммерческие варианты методики выполнения флоккуляционных тестов (VDRL, USR, RPR, TRUST), отличающиеся как по техническим параметрам проведения реакции, так и по применяемому антигену (соотношению композитных частей).
Флоккуляционные реакции на основе кардиолипинового антигена относят к нетрепонемным реакциям по причине того, что антиген получают не из возбудителя сифилиса (бледной трепонемы), а при технологическом соединении высокоочищенных биологических реагентов животного происхождения (холестерина, кардиолипина и лецитина). Соотношение ингредиентов антигена в настоящее время стандартизировано.
RPR – быстрый плазмареагиновый тест
Быстрый плазмареагиновый тест RPR — это быстрый тест для качественного и количественного определения реагиновых антител в сыворотке или плазме крови. Его относят к макроскопическим нетрепонемным флоккуляционным тестам по выявлению антител, ассоциированных с сифилисом.
1. История метода
Эта реакция была разработана J.Portnoy и соавторами (1957) для массового и быстрого скрининга населения с использованием образцов сыворотки или плазмы. Реакция проводится на пластиковых планшетах с впечатанными кружочками.
2. Принцип метода
При добавлении к плазме или сыворотке крови больного сифилисом суспензии стабилизированного кардиолипинового антигена в смеси с мелкодисперсными частицами древесного угля происходит образование комплексов антиген-антитело, собирающих частицы древесного угля в более крупные агрегаты; при этом результат реакции становится возможным учитывать невооруженным глазом.
3. Постановка теста
Авторы метода в 1961 году предложили модификацию RPR на специальных картонных карточках с выдавленными круглыми плоскими неглубокими лунками диаметром 18 мм.
Капля исследуемого образца (неразведенная плазма или сыворотка крови) смешивается в лунке с каплей стабилизированного стандартного кардиолипинового антигена, в который добавлены частицы мелкодисперсного угля (RPR-антиген). Затем в течение 8 мин планшету вращают на орбитальном ротаторе со скоростью 100 об.
/мин, чем достигается стандартизация условий равномерного перемещения нанесенных реагентов. В состав набора входят положительный и отрицательный контроли. Учет результатов проводится при хорошем освещении, когда еще не высохла поверхность кружка. При образовании комплексов антиген-антитело мелкодисперсные частицы угля попадают в образовавшуюся сеть и коагулируют.
Для определения специфического характера позитивных результатов исследования крови в RPR проводят дополнительные исследования в подтверждающих реакциях, основанных на применении антигенов бледной трепонемы (ИФА, РПГА, РИФ, РИТ).
4. Учет результатов
«положительный» — при обнаружении средних и больших агрегатов,
«слабоположительный» — выявляются редкие небольшие агрегаты,
https://www.youtube.com/watch?v=upload
«отрицательный» — ровная серая поверхность без видимых агрегатов.
При положительных результатах рекомендуется исследовать RPR-тест в полуколичественной постановке (разведения от 1:2 до 1:1024).
5. При каких периодах заболевания лучше использовать
https://www.youtube.com/watch?v=ytpolicyandsafetyru
Реакция становится положительной спустя 2—4 недели после появления твердого шанкра.
Ограничениями применения метода RPR являются ранние стадии сифилиса (период инкубации, начало первичного периода), так как данная реакция становится позитивной лишь спустя 2—4 недели после появления твердого шанкра, и поздние стадии (поздний скрытый и третичный сифилис), так как лабильные преципитины первыми элиминируются из организма при длительном течении сифилитической инфекции.
6. Чувствительность и специфичность
Специфичность RPR-теста составляет 98%, а чувствительность зависит от стадии заболевания: при первичном сифилисе — 86%, при вторичном — 100%, при скрытых формах — 98%, при позднем сифилисе — 73% (Кунгуров Н.В. и соавт., 2002).
7. Область применения метода
Применение указанной реакции при серодиагностике сифилиса регламентировано Приказом Минздрава РФ №87 от 26 марта 2001 года «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса» (приложением №1 «Постановка отборочных и диагностических тес¬тов на сифилис»).
Содержание антител-преципитинов в крови после адекватного специфического лечения сифилиса постепенно понижается, что находит отражение сначала в снижении титров, а затем и степени позитивности RPR, которая из резко положительной становится слабоположительной, а затем — отрицательной. В связи с этим RPR используют для оценки эффективности лечения и как один из критериев установления излеченности или при дифференциальной диагностике реинфекции.
8. Источники и причины ошибок при постановке, ложноположительные и ложноотрицательные результаты
Ложноотрицательные результаты. Точно так же, как и в тесте VDRL, при постановке RPR «феномен прозоны» может наблюдаться при постановке с выоскореактивными образцами сывороток. Этот эффект иногда возникает при анализе сывороток, взятых у больных вторичным сифилисом. Поэтому при постановке рекомендуется титрование до тех пор, пока результат не станет однозначным, особенно в случае позитивности трепонемного теста для этого же пациента.
Ложноположительные результаты (ЛПР) могут быть острыми и хроническими, в зависимости от того, насколько долго они сохраняются: острые — менее 6 месяцев, хронические — 6 месяцев и более.
Причины острых ЛПР: гепатит, мононуклеоз вызыванный вирусом Эпштейн-Барра, вирусная пневмония, малярия, прививки, беременность, сердечно-сосудистые заболевания, технические ошибки при постановке реакции.
Причины хронических ЛПР: болезни соединительной ткани, болезни иммунной системы, наркомания, лепра, туберкулез, онкопатология, ВИЧ-инфекция, сердечно-сосудистые заболевания, многочисленные переливания крови.
Технические причины ошибочных результатов теста RPR
Реакция быстрого определения реагинов плазмы крови с кардиолипиновым антигеном является относительно несложным исследованием; тем не менее при ее выполнении необходимо соблюдать все рекомендации производителей диагностикума и правила работы в клинико-диагностической лаборатории.
Источником ошибок при постановке RPR могут являться следующие моменты:
•исследование в реакции гиперлипидемичной, гемолизированной сыворотки крови или образцов с признаками бактериального пророста;
•исключение из постановки реакции контрольных сывороток крови, в частности, слабо-положительных;
•неравномерная концентрация антигена в диагностикуме вследствие недостаточного его перемешивания перед использованием;
•нарушение сроков учета результатов реакции, подсыхание реакционной среды на пластинах с формированием псевдофлоккулятов в краевой зоне;
•нарушение сроков и условий хранения антигена и физиологического раствора; использование диагностикума с истекшим сроком годности;
•несоблюдение параметров работы орбитального шейкера (скорости и времени вращения);
•использование при постановке реакций загрязненных пробирок, пипеток, наконечников пипеточных дозаторов, реакционных пластинок, растворов;
•недостаточная тщательность выполнения последовательных двукратных разведений.
Вышеуказанные ошибки могут приводить к появлению как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов реакции.
9. Особенности, преимущества и недостатки
Методика исследования в RPR проста в исполнении, недорога, не требует специального оборудования и не занимает длительного времени; при этом реакция демонстрирует высокую чувствительность и специфичность. Большинство исследователей отмечают самую высокую чувствительность RPR среди нетрепонемных тестов при всех стадиях сифилиса.
Важным условием является то, что все производимые в мире RPR-наборы являются стандартизированными, что делает их результаты сопоставимыми. Вместе с тем положительные результаты RPR-теста не могут безоговорочно трактоваться как наличие сифилитической инфекции в организме исследуемого пациента без подтверждения трепонемными тестами. RPR-тест непригоден для исследования спинномозговой жидкости.
RPR-тест не является строго специфической реакцией на сифилис. В сыворотке крови людей реагиновые антитела нередко обнаруживают при системных поражениях паренхиматозных органов (печени, почек, легких), при инфаркте миокарда, пневмонии, сотрясении мозга, атеросклерозе, при коллагенозах, онкологических заболеваниях, ряде инфекций (туберкулезе, сыпном тифе, малярии, лепре), при ревматизме, некоторых патологических и физиологических состояниях (тиреотоксикозе, беременности, менструации). Положительные результаты RPR наблюдают после злоупотребления алкоголем, приема жирной пищи, на фоне медикаментозной терапии. Количество ложноположительных результатов увеличивается при исследовании образцов крови пожилых людей.
